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細胞凍存

細胞生物學(xué)研究中，為了更好而長期地研究細胞生物學(xué)功能，需要將良好狀態(tài)的細胞保存起來，以備將來使用。

在不附加任何保護劑下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細胞。貯存在負 130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細胞凍存時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，待復(fù)蘇時重新進入生長分裂周期。

一、實驗前準(zhǔn)備

實驗開始前，將凍存管、15 毫升離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超凈工作臺，以紫外線照射 30 分鐘。采用通風(fēng)機通風(fēng) 3 分鐘。以 75%酒精擦拭操作臺和雙手。準(zhǔn)備好冰盒。

將離心機調(diào)節(jié)至 800 轉(zhuǎn)，5 分鐘。水浴箱調(diào)節(jié)至 37 度恒溫。取細胞完全培養(yǎng)基、DMSO、胰蛋白酶等，放于水浴箱中預(yù)熱。

首先消毒雙手和超凈臺。取約 10 毫升細胞完全培養(yǎng)基放于 15 毫升離心管中。

配置細胞凍存液：凍存液應(yīng)該提前配制，置于室溫備用，防止臨時配制產(chǎn)生的熱量損傷細胞，按無血清培養(yǎng)基 比 血清 比 DMSO=7:2:1 的比例配置細胞凍存液，其中加大凍存液中血清的比例對于保存某些脆弱的干細胞以及一些比較珍貴的細胞很有好處的。

按比例加好凍存液組分后，輕輕吸打混勻，置于室溫下待用。

二、胰蛋白酶/EDTA 消化

從細胞培養(yǎng)箱中取出細胞，進行瓶口消毒，棄去細胞原來的培養(yǎng)基。按每 25 平方厘米1 毫升胰酶/EDTA 消化液比例加入消化液，放入顯微鏡下觀察，待所有細胞變圓后立即拿入超凈臺內(nèi)，加入兩毫升細胞完全培養(yǎng)基以立即終止消化。

采用無菌槍頭輕輕吹打細胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有細胞懸液放入一干凈的 15 毫升離心管內(nèi)。

配平離心：采用天平配平兩端，每分鐘 800 轉(zhuǎn)，室溫離心 5 分鐘。

三、細胞計數(shù)

采用羅氏 CASY-DT 快速細胞計數(shù)及活率分析儀進行細胞計數(shù)。加入 10 毫升 CASY-ton至以標(biāo)記 viable 的管子中，加入 100 微升細胞懸液，顛倒混勻三次，可進行細胞計數(shù)。可見每毫升懸液中有活細胞總數(shù)。

四、細胞凍存

取出凍存管，注明細胞名稱、代數(shù)、日期。

離心后，以無菌吸管吸棄上清液，不要吸到底部的細胞沉淀。將細胞沉淀與凍存液充分混勻，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，將細胞總數(shù)調(diào)節(jié)至細胞數(shù)量為每毫升有 5 乘 10 的五次方為宜。

將細胞凍存懸液分裝入細胞凍存管中，一般一個兩毫升凍存管裝入 1 至 1.5 毫升細胞凍

存懸液為宜。

嚴(yán)密封口后，進行程序性降溫凍存：

首先 4 度 30 分鐘，負 20 度 30 分鐘，負 80 度過夜，最后進行液氮保存。

另有一種比較實用的降溫方法：用最少兩厘米厚的醫(yī)用棉紗將凍存管緊緊包裹，扎緊，直接放入-70 度冰箱，隔夜取出凍存管直接放液氮凍存。或直接采用程序性降溫盒更為方便。

五、注意事項

1、細胞活力及濃度

細胞應(yīng)在生長良好、致密度約為 80-90％、數(shù)目一般為 106 -107 /ml，活力達 90%以上的狀態(tài)下凍存。細胞活力差的細胞在凍存后的成活率很小，因此，一定要在細胞旺盛分裂時期凍

存。

2、注意冷凍保護劑之品質(zhì)

DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色，可以用 0.22 微米濾膜過濾，或者直接購買無菌產(chǎn)品。以 5-10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。

使用 DMSO 前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保存效果。在常溫下，DMSO 對人體有害，故在配制時最好帶上手套。混勻 DMSO 要快，因為 DMSO 對細胞有毒性，混合后應(yīng)盡快凍存。尤為值得注意的是細胞中加入凍存液后，一定要混勻，防止 DMSO 沉淀。

3、提前配制凍存液

凍存液應(yīng)該提前配制，置于室溫備用，防止臨時配制產(chǎn)生的熱量損傷細胞。

4、實行細胞慢凍的原則

緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶，導(dǎo)致細胞損害。對于大多數(shù)細胞來說，每分鐘降 1-3℃是合適的。相反，若不緩慢冷凍，造成的結(jié)晶就大，大結(jié)晶會引起細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。

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