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丙二醛(malondialdehyde ,MDA)含量試劑盒說明書微量法
更新時(shí)間:2024-03-21 點(diǎn)擊量:1100

丙二醛(malondialdehyde MDA)含量試劑盒說明書 微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸,生成過氧化脂質(zhì);后者逐漸分解為一系列復(fù)雜的化 合物,其中包括MDA 。通過檢測(cè)MDA的水平即可檢測(cè)脂質(zhì)氧化的水平。

測(cè)定原理:

MDA與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid TBA)縮合,生成紅色產(chǎn)物,在532nm有最大吸 收峰,進(jìn)行比色后可估測(cè)樣品中過氧化脂質(zhì)的含量;同時(shí)測(cè)定600nm下的吸光度,利用532nm 600nm下的吸光度的差值計(jì)算 MDA  的含量。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96  孔板、 研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配置:

提取液:液體 100mL× 1  瓶,4℃保存;

試劑一:液體 30mL× 1  瓶,4℃保存;

注意事項(xiàng):

臨用前注意試劑一是否完全溶解,如未溶解,可以70℃加熱,并振蕩以促進(jìn)溶解。

MDA  提取:

1 、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為500~ 10001比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液), 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W ,超3s ,間隔10s ,重復(fù)30);8000g 4℃ 離心10min ,取上清,置冰上待測(cè)。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~ 10的比例(建議稱取約0. 1g組織,加 1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min ,取上清,置冰上待測(cè)。

2 、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟:

1 、吸取0.3mL試劑一于1.5mL離心管中,再加入0. 1mL樣本,  混勻。

295℃水浴中保溫30min(蓋緊,防止水分散失),置于冰浴中冷卻,10000g25℃ , 離心10min 3、吸取200μL上清液于微量石英比色皿或96孔板中,測(cè)定532nm600nm處的吸光度,記A532  A600 ΔA= A532-A600

MDA  含量計(jì)算:

a.  用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1 、血清(漿)中 MDA  含量的計(jì)算:


MDA  含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷V  =25.8 ×ΔA

2 、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中 MDA  含量計(jì)算

1)按照蛋白濃度計(jì)算

MDA含量(nmol/mg prot)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(Cpr×V  )=25.8 ×ΔA ÷Cpr 需要另外測(cè)定,建議使用本公司 BCA  蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

2)按照樣品質(zhì)量計(jì)算

MDA含量(nmol/g  鮮重)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)× 109]÷(W×V÷V樣總)

=25.8 ×ΔA ÷W

(3 )  按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(500×V  ÷V  樣總)=0.0516×ΔA

V  反總:反應(yīng)體系總體積, 4 × 10-4Lε :丙二醛摩爾消光系數(shù),155× 103L/mol/cmd:比色 皿光徑,1cmV  樣:加入樣本體積,0. 1 mLV  樣總:加入提取液體積,1 mLCpr:樣本 蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。

b.96  孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1 、血清(漿)中 MDA  含量的計(jì)算:

MDA含量(nmol/mL)=[ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷V  =51.6 ×ΔA

2 、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中 MDA  含量計(jì)算

1)按照蛋白濃度計(jì)算

MDA含量(nmol/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)× 109]÷(Cpr×V  )=51.6 ×ΔA÷Cpr 需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

2)按照樣品質(zhì)量計(jì)算

MDA含量(nmol/g  鮮重)=[ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(W×V÷V樣總)=51.6 ×ΔA÷W (3 )  按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(500×V  ÷V  樣總)=0.1032×ΔA

V  反總:反應(yīng)體系總體積,4 × 10-4Lε :丙二醛摩爾消光系數(shù),155× 103L/mol/cmd96孔板 光徑,0.5cmV  樣:加入樣本體積,0. 1 mLV  樣總:加入提取液體積,1 mLCpr:樣本 蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500  萬(wàn)。

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